当前，安全高效地将大分子递送至细胞是许多新兴治疗方法面临的挑战。病毒载体存在一些局限性，如货物尺寸限制、DNA整合风险和基因编辑剂的长期表达等。非病毒递送方法虽能减少脱靶编辑，但在肝外组织的治疗应用中仍面临困难。2024年11月，Aditya Raguram等研究人员在Nature Biotechnology上发表了题为“Directed evolution of engineered virus-like particles with improved production and transduction efficiencies”的研究论文。研究团队此前开发的Engineered virus-like particles（eVLPs）在细胞培养和小鼠体内展现出高效的蛋白递送和基因编辑能力，但仍需进一步改进其特性。为实现这一目标，他们开发了一种定向进化系统，该系统通过在eVLP包装的核糖核蛋白（ ribonucleoprotein，RNP）货物中加载含有条形码序列的引导RNA来识别不同的eVLP变体。

研究人员首先验证了条形码引导RNA与功能性eVLP生产的兼容性，并证明其可用于区分具有不同功能特性的eVLP变体。接着，他们应用该系统对eVLP衣壳进行突变和选择，发现野生型鼠白血病病毒（Moloney murine leukemia virus，MMLV）衣壳不利于包装非天然蛋白货物，通过重塑衣壳内表面可改善eVLP的特性。通过对生产和转导选择的结果分析，研究人员确定了一组有潜力的衣壳突变体，并进一步评估了它们的效力。最终，他们开发出了第五代（v5）eVLPs，其在多种细胞系和人源造血干细胞和祖细胞（hematopoietic stem and progenitor cells，HSPCs）中均表现出v4 eVLPs更高的基因编辑效率。此外，研究还发现v5 eVLPs在货物包装和释放、衣壳结构和粒子大小等方面均有改进。这些改进使得v5 eVLPs在基因编辑应用中具有更高的潜力，有望为基因治疗和基础研究提供更有效的工具。该研究为开发改进的eVLPs提供了一种新的方法，有望推动基因编辑技术的发展，为治疗多种疾病带来新的希望。

图1 条形码eVLP进化系统的验证。a，条形码eVLP进化系统概述。b，模拟生产选择实验的示意图，其中条形码1与功能性Gag-ABE构建体相连，条形码2与非功能性ABE仅（无Gag）构建体相连。c，在生产细胞genomic DNA（gDNA）或eVL包装的 single-guide RNAs（sgRNAs）中检测到的条形码1 或2的频率。d，模拟转导选择实验的示意图，其中条形码1与野生型 vesicular stomatitis virus G（VSV-G）包膜蛋白相连，条形码2与受损的VSV-Gmut包膜蛋白相连。e，在eVLP包装的sgRNA或递送的sgRNA中检测到的条形码1或2的频率。

图2 条形码eVLP衣壳选择。a，条形码eVLP衣壳文库生成示意图。b，改进eVLP生产和改进eVLP转导的选择概述。c，生产选择和转导选择中每个衣壳突变体的平均条形码富集值。

图3 v5 eVLP的表征。a，v5 eVLP中GagQ226P-Pro-Pol内的Q226P突变体示意图，位于内部p12-衣壳蛋白酶切割位点的直接下游。b，v5 eVLP中GagC507V-ABE内的C507V突变体示意图，位于核衣壳结构域的CCHC锌指基序内。c，在v4或v5 eVLP 中检测到的裂解ABE货物的百分比。d，通过抗Cas9和抗MLV（p30）ELISA定量每个eVLP的ABE分子（方法）。e，使用sgRNA 特异性引物通过RT-qPCR测量eVLP包装的sgRNA丰度的倍数变化，相对于v4 eVLP中的sgRNA丰度进行归一化。c–e，条形反映n = 3个仿行的平均值，点表示单个仿行值。f，v4 eVLP的代表性冷冻电镜图像。g，v5 eVLP的代表性冷冻电镜图像。比例尺，50nm。h，在v4或v5 eVLP的冷冻电镜图像中观察到的eVLP衣壳类型的分类和定量。条形反映了n=551个总v4 eVLP或 n=577个总v5 eVLP的样本比例的平均±s.e.m.。i，定量冷冻电镜图像中观察到的每个包络v4（n = 384）或包络v5 eVLP（n=438）的颗粒直径。颗粒计数的离散直方图用Akira样条曲线进行插值。

原文链接：Directed evolution of engineered virus-like particles with improved production and transduction efficiencies | Nature Biotechnology

doi：10.1038/s41587-024-02467-x