随着抗生素耐药细菌的增加，镓等非抗生素疗法越来越受到关注。静脉注射硝酸镓正在进行II期临床试验，以治疗囊性纤维化患者的慢性铜绿假单胞菌感染。然而，其临床疗效受到人体组织中可达到的峰值浓度的限制。为了解决这一局限性，2025年7月1日，深圳大学医学部基础医学院及卡尔森国际肿瘤中心刘雪副教授团队在《Nature Communications》上发表了题为“CRISPRi screen identifies FprB as a synergistic target for gallium therapy inPseudomonas aeruginosa”的研究论文。该团队应用全基因组CRISPR干扰方法（CRISPRi-seq）来鉴定与镓的潜在协同靶点。根据反应时间和生长减少对必需基因进行分类，找出该物种中最脆弱的治疗靶点。此外，该团队鉴定出一个高度保守的基因fprB，编码铁氧还蛋白NADP⁺ 还原酶，其缺失使铜绿假单胞菌对镓敏感，将其MIC降低32倍，并将作用模式从抑菌转变为杀菌。进一步的研究表明，FprB通过控制铁稳态和活性氧积累，在调节镓诱导的氧化应激中起着关键作用。敲除fprB增强了镓对生物膜形成的疗效，并改善了铜绿假单胞菌小鼠肺部感染模型的结果，表明FprB与镓联合使用是一种有前景的药物靶点。总体而言，本研究表明CRISPRi-seq是铜绿假单胞菌系统遗传分析的有力工具，促进了新治疗靶点的鉴定。

图1 在P. aeruginosa建立tet-inducible CRISPRi系统

a，铜绿假单胞菌四环素和阿拉伯糖诱导报告系统的评价。通过测量不同浓度的强力霉素（Dox）或L-阿拉伯糖诱导的luxABCDE表达的发光来评估疗效。b，tet诱导型CRISPRi系统的示意图。该系统采用SpydCas9-sgRNA复合物，该复合物通过sgRNA中的20个碱基对序列定向到DNA靶区，通过空间位阻抑制转录。dcas9的表达由P_tet启动子驱动，sgRNA由组成型启动子表达。c，用靶向phzM的CRISPRi对菌株进行Pycyanin测量。上图显示了培养管的照片，下图显示了绿脓杆菌素定量。d，e CRISPRi对群集运动的抑制。d，表示指定菌株在指定浓度Dox的培养基上的群集菌落，e，表示菌落表面直径的测量值。f，tet诱导型CRISPRi系统在铜绿假单胞菌中的可逆性。25或100 ng/mL Dox在OD₆₀₀=0.001时诱导luxABCDE的抑制。在去除Dox并在7.5小时稀释后，在回收的培养物中测量发光。LB培养基作为阴性对照。g，靶向ftsZ的CRISPRi敲除菌株在LB培养基中随着Dox浓度的增加而在各种铜绿假单胞菌背景中生长。h，基于CcdB的sgRNA克隆策略。ccdB基因两侧有用于金门组装的BsaI位点；用sgRNA替换可以在CcdB敏感的WM3064菌株的LB琼脂上形成集落。i，使用CcdB计数器选择系统评估sgRNA克隆效率。克隆了三个sgRNAs，从每个克隆中随机挑选十个菌落并测序。所有生长和测量分析的数据均以三个生物重复的平均值±标准差表示。使用双向方差分析和Tukey多重比较检验对面板c和e进行统计分析。

图2 通过CRISPRi-seq技术鉴定铜绿假单胞菌的关键基因

a，CRISPRi文库构建和适应性评估的工作流程。合成了寡核苷酸（集合1和2），以创建针对5981和5971基因的sgRNA文库。这些寡核苷酸随后通过PCR扩增形成双链DNA，随后克隆到pCRISPRi-ccdB中。得到的质粒被转化到大肠杆菌WM3064中，以生成sgRNA文库，这些文库通过三亲本交配整合到PA14染色体中。CRISPRi对池中菌株适应性的影响在大约7天（G7，~5小时在指数生长期）、14天（G14，~10小时）和21天（G21，~15小时）后进行了评估，使用Illumina测序和DEseq2比较文库中有无CRISPRi激活（Dox +/−）的间隔丰度。b，通过CRISPRi-seq和Tn-seq识别的必需基因的基因组定位。外部蓝色、红色和青色轨迹代表在先前的Tn-seq筛选中被注释为必需的基因，而紫色轨迹代表在本研究中使用CRISPRi-seq识别的基因。c， CRISPRi-seq和Tn-seq筛选的候选必需基因集的比较分析。d，e 线图显示非必需基因（d）和必需基因（e）在CRISPRi数据中的log₂FC趋势。黑点代表sgRNA的log₂FC值。实线黑色线条表示在不同世代（0、7、14和21）下个体均值线性回归的局部估计散点平滑拟合。条形图显示基于可用的COG术语和补充图2c中定义的手动分类的每个簇的适应性变化基因的功能分类（前5名）。

图3 使用CRISPRi-seq鉴定与Ga(NO₃)₃治疗敏感性相关的基因

a，用于筛选对Ga(NO₃)₃处理敏感的基因的工作流程。用Dox（25 ng/ml）诱导CRISPRi文库14代，然后在有或没有200 μM Ga(NO₃)₃的情况下培养。b，PA14在不同浓度Ga(NO₃)₃的LB肉汤中的生长曲线。c，火山图显示了与Ga(NO₃)₃耐受性有关的已鉴定基因。d，对照菌株PA14和携带具有非靶向sgRNA的CRISPRi系统的PA14的生长（lucff）。e，验证与适应度增加相关的靶点：hitA、hitB、PA14_67550、PA14_56670，以及使用CRISPRi结合单个sgRNAs的iE。f，描绘HitAB参与铜绿假单胞菌对Ga³⁺和Fe³⁺摄取的示意图。g，验证适合度降低的筛查命中率。构建了靶向PA14_22320、fdx2、fprB的敲除菌株，并在含有指定浓度镓和Dox的培养基中测试了它们的生长。在选定浓度的Ga(NO₃)₃下的代表性表型,示出了被选择为最好地说明微分灵敏度的图。h，说明FprB在NADP（h）依赖性电子转移中作用的示意图。i平板斑点试验显示PAO1突变体对镓的敏感性。所有生长数据均以三个生物重复的平均值±标准差表示。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-025-61208-z

DOi：10.1038/s41467-025-61208-z