2024年6月，来自陆军军医大学基础医学院微生物学系的乐率等人在《Nature Microbiology》（IF=20.5）上发表了名为“Bacteriophage protein Dap1 regulates evasion of antiphage immunity and Pseudomonas aeruginosa virulence impacting phage therapy in mice”的文章。该研究报道了铜绿假单胞菌噬菌体PaoP5中鉴定了一种名为Dap1的噬菌体蛋白，它既调节了细菌的宿主行为，又有助于噬菌体的适应性。该研究表明铜绿假单胞菌中Dap1的表达干扰了c-di-GMP磷酸二酯酶DipA，引起c-di-GMP水平的增加，从而引起了细菌表型的变化，使细菌的运动性降低并促进生物膜的形成。在PAO1中过表达Dap1，显著抑制了细菌的泳动运动和群集运动，同时与空载体的PAO1相比，PAO1/p-dap1菌株显著增加了生物膜生物量，且生物膜形成呈IPTG剂量依赖性。

细菌腺苷酸环化酶双杂交（BACTH）检测和免疫共沉淀（CO-IP）的结果表明Dap1表达引起的细菌行为改变是通过其与DipA的相互作用介导的。DipA是一种c-di-GMP磷酸二酯酶。dipA的失活导致细胞c-di-GMP水平增加，并抑制鞭毛马达的转变和泳动。小鼠感染实验显示，80%的PAO1/pUCP感染小鼠在2天内死亡，而所有的PAO1/pUCP-dap1感染小鼠在第5天显示100%的生存率。这表明，噬菌体蛋白Dap1的表达抑制了铜绿假单胞菌的致病性。

敲除PaoP5中的dap1基因，噬菌体形成噬斑变小，而噬斑大小与爆发大小相关。结果显示PaoP5Δdap1比PaoP5产生的子代更少，PaoP5Δdap1产生的子代数量仅为野生型噬菌体PaoP5的13.83%。HNH核酸内切酶，它是噬菌体DNA包装机器的重要组成部分，当hnh过表达时PaoP5Δdap1能够形成大的斑块。PaoP5中dap1的缺失显著降低了噬菌体基因组的包装，电子显微镜显示噬菌体PaoP5Δdap1裂解物产生了大量的空噬菌体颗粒。而在PAO1中表达dap1或hnh完全恢复了DNA包装效率至野生型噬菌体水平。这表明，当PaoP5Δdap1感染PAO1时，噬菌体HNH内切酶显著降解，用噬菌体DNA包装的衣壳更少，产生的子代也更少。

铜绿假单胞菌的蛋白酶Lon可能参与了降解HNH内切酶，研究人员使用PaoP5Δdap1感染野生型PAO1和Δlon，结果显示，PaoP5Δdap1在Δlon中形成的噬斑比在PAO1中形成的斑块更大。电子显微显示PaoP5Δdap1的大多数子代DNA在Δlon中被包装。此外，与PaoP5Δdap1感染PAO1相比，PaoP5Δdap1感染Δlon的HNH内切酶丰度显著增加，说明没有Lon，噬菌体HNH内切酶未被显著降解。在这种情况下，Dap1直接与噬菌体HNH核酸内切酶结合，阻止宿主Lon介导的HNH降解，促进噬菌体基因组包装。

此外，PaoP5Δdap1未能挽救受铜绿假单胞菌感染的小鼠，感染复数（MOI）为10的噬菌体PaoP5单次剂量可拯救100%的腹腔感染铜绿假单胞菌的小鼠。当用单剂噬菌体PaoP5Δdap1处理腹腔感染铜绿假单胞菌的小鼠时，所有小鼠均在7日内死亡，但小鼠的死亡时间延迟，这显示出dap1在噬菌体治疗中的意义。总之，这些结果突出了噬菌体蛋白的双重功能，能够调节宿主的行为和确保噬菌体的适应性。

图1.PaoP5Δdap1形成小噬斑，产生较少的后代。

(a) PaoP5Δdap1形成小的噬菌体斑块，而PaoP5Δorf014和PaoP5Δorf153作为对照显示出与野生型PaoP5相似的噬菌体斑块。(b) PaoP5Δdap1突变体形成的斑块比野生型PaoP5更小。(c) PaoP5Δdap1和PaoP5噬菌体均能有效吸附PAO1。(d)一步生长曲线显示PaoP5Δdap1比PaoP5产生更少的子代。(e)  PaoP5Δdap1和PaoP5的爆发大小为14.52±3.62 PFU/cell和104.95±17.14 PFU/cell。

图2.PaoP5Δdap1由于HNH内切酶的丰度降低，基因组包装效率较低。

(a) PaoP5与PaoP5Δdap1感染PAO1噬菌体蛋白的差异表达。(b) PaoP5Δdap1感染PAO1/p-orf050后形成的斑块比感染PAO1/EV或PAO1/p-orf049后形成的斑块大。(c) PAO1、PAO1/p-dap1或PAO1/p-orf050产生的负染噬菌体的代表TEM。(d) 在指示菌株中培养噬菌体，计算3次生物重复序列中基因组包装的衣壳百分比。

图3.Lon蛋白酶降低HNH内切酶的丰度，抑制PaoP5Δdap1噬菌体基因组包装。

(a) PaoP5Δdap1在Δlon上形成大斑块，在Δlon/p-lon上形成小斑块。(b) PAO1和Δlon产生的负染噬菌体的代表性透射电子显微图。(c)在指示菌株中培养噬菌体，计算基因组包装的衣壳百分比。(d)通过LC-MS /MS分析PAO1或Δlon感染PaoP5Δdap1的DEPs的火山图。(e)使用PaP_Se、PaP8、JG004三个铜绿假单胞菌噬菌体攻击PAO1和Δlon。

DOI：10.1038/s41564-024-01719-5

原文链接：Bacteriophage protein Dap1 regulates evasion of antiphage immunity and Pseudomonas aeruginosa virulence impacting phage therapy in mice | Nature Microbiology