2024年11月6日，加州理工学院Dianne K. Newman教授团队在PNAS（IF = 11.205）发表突破性研究，首次揭示铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）通过主动产生氧化还原活性代谢物（RAMs），抑制自身能量代谢，从而在抗生素攻击下存活。这一发现为破解细菌耐药性难题提供了全新视角，并为开发靶向能量通路的抗菌策略奠定基础。

铜绿假单胞菌是医院获得性感染的主要病原体，常导致肺炎、烧伤感染和囊性纤维化患者肺部慢性感染。其耐药性难题的根源之一在于生物膜形成和“持久菌”（persister cells）的存在，这些细胞通过降低代谢活性逃逸抗生素杀伤。然而，细菌如何主动调控能量状态进入“休眠”仍不明确。研究团队提出大胆假设：细菌可能通过自产毒素“自损”以换取生存机会。

研究团队聚焦于铜绿假单胞菌产生的三类RAMs——绿脓菌素（PYO）、吩嗪-1-羧酰胺（PCN）、吩嗪-1-羧酸（PCA）以及伯克霍尔德菌属产生的毒素黄素（TOX），发现它们在富氧环境中发挥以下作用：

1. 快速降低膜电位（ΔΨ）：

使用荧光染料DiOC₂(3)实时监测发现，PYO和TOX在15分钟内显著降低细菌膜电位，而PCA效果较弱。膜电位下降幅度与抗生素保护效果直接相关。例如，PYO处理使细菌对妥布霉素（tobramycin）的存活率提高10倍以上。

图1. RAM生物能抑制延伸至聚集的生物膜，保护（超）氧带中的细胞。(A)ABBA的图形说明。(B)PYO可显著保护ABBA免受妥布霉素的影响，而对环丙沙星的影响较小。（RAM降低Δphz细胞悬液的ΔΨ、质子泵和细胞ATP水平。(A)经验累积分布函数（ECDF）显示了处理1小时的代表性细胞悬浮液的DiOC 2（3）红/绿色荧光比率。尼日利亚霉素使ΔΨ升高，PYO和CCCP使Δ Ψ降低，每种情况包含50，000个事件。(B)代表性的单次重复呼吸质子易位的测量，从全细胞对作为空气-平衡水加入的氧脉冲的响应。有关条件，请参见材料和方法。(C)代表性的重复试验显示质子易位抑制对PYO浓度增加的反应。在氧脉冲开始前，将细胞与加入的PYO一起温育1.5分钟。(D)ECDF显示处理1小时的代表性细胞悬浮液的DiOC 2（3）红/绿色荧光比率。PYO、PCN、PCA、TOX和CCCP降低ΔΨ。PCA的影响很小。每个条件包含50，000个事件。(E)各种RAM的质子易位抑制。RAM：O是在单个氧脉冲中存在的RAM与添加的O原子的摩尔比。每个数据点是两次生物学重复测定的平均值，误差线代表SD。在最高浓度的毒黄素下未检测到质子易位。(F)从细胞裂解液中测得的细胞ATP浓度（10−10 nmol/CFU）表明，与PCA孵育1小时不会引起细胞ATP水平的变化，而PCN、PYO、TOX和CCCP均会降低细胞ATP水平。误差条代表95% CI。每个数据点代表一个生物重复。

2. 抑制质子泵与ATP生成：

通过质子泵实验发现，RAMs干扰呼吸链电子传递，使每分子氧气泵出的质子数（H⁺/O）减少，能量转化效率下降。ATP浓度测定显示，PYO和TOX使细菌ATP水平降低50%以上，导致细胞分裂停滞（通过微流控显微成像证实）。

图2. RAM不同程度地降低了ΔΨ，并在孵育1小时后产生独特的群体分布，预测了它们对细胞悬液抗妥布霉素的保护程度。(A)在PBS中孵育1小时后，RAM以不同的速率和不同的幅度降低ΔΨ。数据点是三个生物重复样品的DiOC 2（3）值的平均值的平均值，归一化为15 μ min No-μ RAM条件。误差线代表SD。每个数据点代表150，000个事件。(B)在PBS ± RAM中孵育1小时，然后加入100 µg/mL妥布霉素孵育2小时后，RAM差异性地增加了妥布霉素的存活率。数据点是三次生物重复测定的对数转换CFU/mL值。误差线表示95% CI。（C和D）RAM产生独特的ΔΨ亚群。在PBS中孵育导致去极化的亚群，而PYO可以缓冲ΔΨ，其水平类似于最去极化的No-RAM亚群。特定孵育和时间点的代表性重复样品的DiOC ₂（3）值直方图。将数值标准化为No-μ RAM 15-μ min时间点。每一行代表50，000个事件。

3. 动态调控与可逆性：

移除PYO或使用尼日利亚菌素（nigericin）提高ΔΨ后，细菌对抗生素的敏感性恢复，证明能量抑制具有可逆性。不同碳源（如琥珀酸盐）可逆转能量抑制，提示代谢环境对耐药性的调控作用。

图3. PYO介导的妥布霉素耐受性可随着ΔΨ的增加或PYO的清除而消除，外排泵对该表型并不重要，RAMs对庆大霉素和环丙沙星的保护作用与妥布霉素相似。（A和B）CCCP和PYO保护PBS细胞悬浮液免受妥布霉素的影响，而在PYO和尼日利亚菌素共同处理期间，尼日利亚菌素消除了PYO-β介导的妥布霉素保护作用。(C)用PYO、CCCP、尼日利亚菌素或PYO +尼日利亚菌素（PYO + Nig）共处理的PBS细胞悬浮液的DiOC 2（3）_值的ECDF。尼日利亚菌素使PYO-1处理的细胞ΔΨ增加。(D)1小时后洗去PYO可消除PYO介导的妥布霉素耐受性。(E)外排泵抑制剂治疗不会显著改变PYO-β介导的妥布霉素耐受性。(F)用增加浓度的PYO预处理细胞悬浮液导致更高的妥布霉素耐受性。(G)与妥布霉素相似，RAM对庆大霉素和环丙沙星具有保护作用。（A、B和D-G）对数转换的CFU/mL值。每个数据点代表一个生物学重复，每个实验三或四个重复。误差线代表95% CI。如有虚线，则代表No-μ RAM、非抗生素处理细胞的平均存活率。（A、B和D-G）在1-h预处理后将抗生素加入PBS细胞悬液中（例如PYO）并在CFU铺板前孵育2小时。所用浓度为100 µg/mL妥布霉素、10 µg/mL环丙沙星或200 µg/mL庆大霉素。

该研究不仅为铜绿假单胞菌的治疗提供了新靶点，还提示其他病原菌可能具有类似的能量调控策略。研究团队计划进一步探索代谢物在人体感染微环境中的作用，并开发基于能量代谢的联合疗法。

DOI号：10.1073/pnas.2406555121

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39503891/