近日，江南大学饶志明教授、张显教授团队在《Science Advances》上发表了题为“The two-­component nuclease-­active KELShedu system confers broad antiphage activity via abortive infection”的重要研究成果，首次阐明 KELShedu 双组分系统通过流产感染介导广谱抗噬菌体活性的分子机制。该系统以独特的核苷酸感知模式激活防御，为微生物抗噬菌体工程及新型治疗策略开发奠定了重要基础。

在细菌与噬菌体的永恒进化军备竞赛中，CRISPR-Cas、BREX 等防御系统已被广泛研究，但新型抗噬菌体机制仍有待发掘。饶志明教授团队聚焦肠杆菌科来源的 DUF4263 结构域蛋白，成功鉴定出由 KELA 和 KELB 组成的双组分系统——KELShedu，其在大肠杆菌中能有效抵抗 T1、T7 等多种噬菌体侵袭。

该研究发现并鉴定了大肠杆菌中的KELShedu系统，这是一种双组分抗噬菌体机制，通过流产感染（受感染细菌提前死亡以中断噬菌体生命周期，保护细菌群体的防御机制）保护细菌。与此前报道的单蛋白Shedu系统不同，KELShedu系统由KELA和KELB两种蛋白组成。实验通过噬菌体菌斑测定、细菌生长曲线测量等证实，KELA和KELB均为其抗噬菌体活性所必需——单独表达任一蛋白会显著削弱系统的广谱抗噬菌体能力。进一步研究表明，KELA是一种双链DNA结合蛋白，能非特异性结合双链DNA并稳定KELB的构象；KELB则是一种依赖金属离子的核酸酶，含有DUF4263结构域（属于PD-(D/E)XK磷酸二酯酶超家族），在镁离子或锰离子存在时能降解DNA，但无序列特异性。体内外实验均显示KELA与KELB形成复合物发挥作用。该系统的激活机制与胞内核苷三磷酸（NTP）水平密切相关。正常生理条件下，细胞内的NTP会抑制KELShedu系统的DNA切割活性；当噬菌体入侵时，噬菌体的大量复制和蛋白合成会消耗NTP，导致胞内NTP水平下降，从而解除这种抑制。激活的KELShedu系统会非特异性降解细胞内的DNA（包括细菌基因组DNA和噬菌体DNA），最终诱导流产感染，阻止噬菌体增殖。此外，基于DUF4263结构域的系统发育分析显示，Shedu系统可分为四个主要亚型，从简单的单组分蛋白进化为更复杂的多组分系统，表明其进化多样性。本研究不仅拓展了已知的细菌抗噬菌体机制库，还为微生物工程和合成生物学中保护有价值菌株免受噬菌体侵染奠定了基础。

图 1.双组分Shedu系统赋予噬菌体对大肠杆菌的抗性

（A） KELAB 基因盒包含两个基因，SduA（KELA，333 bp）和SduB（KELB，1086 bp），由 3 bp 的基因间区域隔开。整个 KELAB 基因盒（不包括小写字母）都经过密码子优化。DUF4263超家族结构域位于SduB的 146 至 313 个氨基酸 （aa） 区域内。（B）对KEL80639.1（KELAB）、BAI39103.1、UKB45259.1和EHX83949.1的Shedu防御系统的实验验证。使用连续稀释斑块测定法评估保护功效，将含有 Shedu 系统的菌株与含有空载体作为对照的菌株进行比较。数据代表三个独立实验的平均值。噬菌体种类在相应名称上方标明。右侧描绘了防御系统的基因组成，已识别的DUF4263结构域以黄色突出显示。基因大小是按比例绘制的。（C）KELAB盒在大肠杆菌BL21（DE3）中的表达赋予对噬菌体感染的抗性。所示为噬菌体T1，T7和JNUWH1的十倍连续稀释的斑块测定。这些图像代表了三个独立的重复。（D）表达KELAB盒不同开放阅读框的大肠杆菌BL21（DE3）中的噬菌体抗性。测试了含有 KELA、KELB、整个 KELAB 盒和空载体的菌株。显示的是噬菌体 T1、T7 和 JNUWH1 的十倍连续稀释菌斑测定的结果。这些图像代表了三个独立的重复。

图 2. KELAB可防止噬菌体感染

（A 至 F）KELShedu 防御系统通过流产感染维持细菌生长。表达KELAB的大肠杆菌响应噬菌体感染的生长曲线，噬菌体 T1、T7 和 JNUWH1的不同 MOI。这些曲线代表三个独立实验的平均值，每个实验一式三份进行。误差线表示均值的标准差。虚线矩形标记的区域是检测培养物中噬菌体滴度的采样点。（G）不同细菌裂解物中的噬菌体滴度。为了检测有或没有KELShedu防御系统的死细胞释放噬菌体后代，从上述测定中收集了MOI 100（T1，T7和JNUWH1感染后120分钟）噬菌体感染的死细胞裂解物。然后，测定裂解物中的噬菌体滴度。条形图表示三个独立实验±标准差的平均值。（H）含有空 pET-28a 质粒、KELA、KELB和KELAB基因盒的大肠杆菌BL21（DE3）中蛋白质表达的SDS-PAGE 分析。

图3.当ATP水平下降时，KELShedu 会降解细胞内DNA

(A）携带KELShedu系统的大肠杆菌BL21（DE3）细胞以MOI为2的噬菌体T7感染，使用激光共聚焦显微镜观察其在感染后不同时间点的细胞反应。DAPI 染色用于可视化 DNA，以靛蓝表示，而 FM4-64 染色突出显示细胞膜，以洋红色显示。所有样品的成像条件和参数保持一致。白色箭头代表宿主DNA的降解。所呈现的图像代表了三个独立的重复。（B） 使用qPCR定量感染后不同时间点噬菌体DNA和宿主DNA的相对丰度。空质粒对照组以携带空质粒的细菌为参考组，KELAB组以携带KELShedu系统的细菌为参考组。（C）通过不同浓度的NTP抑制KELAB核酸酶活性（以200 ng添加底物dsDNA，以3 nM添加蛋白质，反应时间为20 min）。采用ImageJ进行灰度分析，中位抑制浓度（IC₅₀）通过与Pharmacology-DoseResp进行非线性拟合获得。（D）生理浓度（5mM）的ADP，AMP，NTPs和dNTPs对KELAB核酸酶活性的抑制率。（E）KELA、KELB和KELAB无ATP/ADP/AMP水解活性。图像代表了三个重复。条形图表示三个独立实验±标准差的平均值。使用学生t检验确定统计学显着性，*P < 0.05，**P < 0.005。

原文链接：https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adv4747

DOI: 10.1126/sciadv.adv4747