近日，武汉大学张帆教授团队在化学领域顶级期刊《Angewandte Chemie International Edition》上重磅发表最新研究成果，成功研发出一条发现新型抗菌药物的高效新路径。该研究创新性地提出“自抗性基因引导挖掘+双功能筛选”的巧妙策略，为对抗耐药菌感染找到了潜在的“新武器”。

在这篇题为“Discovery of Antivirulence ClpP Inhibitors by Self-Resistance Gene-Guided Mining Coupled with Dual Functional Screening”的论文中，团队发现了一系列具有潜力的候选分子。这些分子通过抑制细菌的“毒力因子”，有望瓦解其致病能力，从而开辟一条不同于传统杀菌药的全新治疗赛道，为应对全球日益严峻的抗生素耐药性挑战提供了原创性的解决方案。

与传统抗生素直接杀灭细菌的机制不同，抗毒力疗法通过抑制细菌毒力因子，使其丧失致病能力而不影响其生存。这一策略不仅能减缓耐药性发展，还能避免破坏宿主正常菌群，展现出独特优势。其中，ClpP蛋白酶作为金黄色葡萄球菌中毒力调控的关键蛋白，控制着多种毒力因子的表达，是理想的药物靶点。然而，目前已知的ClpP抑制剂结构类型有限，且尚无候选药物进入临床，开发新型抑制剂迫在眉睫。在自然界中，微生物为抵御自身产生的活性代谢物，进化出了相应的自抗性基因。这些基因通常与代谢产物的生物合成基因簇（BGC）共定位，为活性化合物的发掘提供了"路标"。基于此，研究团队以ClpP蛋白酶为探针，对3.4万余个放线菌基因组进行挖掘，筛选出530个含潜在自抗性基因的BGCs，并优先选择26个进行验证。然而，从复杂的发酵产物中准确鉴定ClpP抑制剂是一大挑战。为此，团队建立了双重筛选方案：先通过荧光底物水解实验初筛发酵液的ClpP抑制活性，再通过ADEP拮抗实验进行验证。ADEF能过度激活ClpP导致细菌死亡，而ClpP抑制剂可拮抗这一过程，恢复细菌生长。通过这一策略，团队最终成功鉴定出Streptomyces sp. S186菌株能产生有效的ClpP抑制剂。

为了深入理解这类化合物的来源并为后续的结构优化提供基础，研究人员解析了streptoclipamides的生物合成途径。首先，通过对Streptomyces sp. S186基因组的生物信息学分析，研究人员鉴定了一个约15个开放阅读框组成的基因簇str。由于原始菌株遗传操作困难，研究者构建了基因组BAC文库，将包含完整str基因簇的BAC转入S. coelicolor M145中异源表达，成功检测到streptoclipamide A的产生，证明了str基因簇负责其生物合成。进一步通过基因敲除实验确定了后修饰基因的功能，如细胞色素P450基因strJ和甲基转移酶基因strK。这些突变体产生了一系列类似物。使用¹³C标记的乙酸钠喂养实验证实了聚酮链的延伸来源于乙酸单元，从而推测了streptoclipamides的生物合成过程。接下来，研究团队在体外多维度验证了streptoclipamide A作为抗毒力候选分子的潜力。Streptoclipamide A能高效地抑制MRSA的ClpP蛋白酶活性。然而，即使在高达500 µM的浓度下，streptoclipamide A也不能对MRSA的生长曲线产生明显影响，这一结果符合抗毒力化合物的特征。进一步的实验表明，该化合物能显著降低MRSA的溶血活性，EC₅₀为32.79 µM。通过Western Blot分析证实，streptoclipamide A对关键毒力因子α-溶血素（Hla）的表达呈现剂量依赖性抑制，因此导致溶血活性的下降。对经过化合物处理的MRSA菌株的毒力相关基因的转录水平分析发现，streptoclipamide A显著下调了全局毒力调控因子（如RNAIII，agrA，saeR）的表达，进而导致一系列关键毒力因子的转录水平急剧下降，包括hla（下降45倍）、lukS-PV/lukF-PV（下降33/16倍）以及psmα（下降220倍）。而clpP基因的表达未受影响，排除了其通过影响靶标的转录来发挥作用的可能性。这些结果从分子水平证明了streptoclipamide A通过抑制ClpP这一调控蛋白，进而影响MRSA的毒力网络。

机制研究方面，研究团队通过蛋白热迁移实验、细胞热迁移实验、表面等离子共振技术以及分子对接模拟，证实了streptoclipamide A与ClpP蛋白之间存在非共价结合。分子对接预测其C-21羟基与ClpP的Thr72残基形成关键氢键，当将Thr72突变为丙氨酸或脯氨酸后，化合物对ClpP的抑制活性显著降低，这支持了分子对接的结果。重要的是，在产生菌的抗性蛋白StrM中，研究者发现了T72P的自然突变，这一发现从进化角度印证了Thr72是streptoclipamide A结合的关键位点，同时揭示了微生物实现自我保护的分子机制。在大蜡螟幼虫和小鼠肺炎模型中，streptoclipamide A与万古霉素联用，表现出显著的协同治疗效果，能够显著提高MRSA感染的大蜡螟幼虫存活率，并且能有效降低感染小鼠肺部的细菌载量，减轻组织病理损伤。

最终，该研究成功验证了“自抗性基因引导+双功能筛选”这一创新策略的强大效能。凭借此策略，团队不仅精准地发现了结构全新的ClpP抑制剂——streptoclipamide A，更在后续研究中完整揭示了其作用机制：该化合物能像“精准钥匙”一样与ClpP特异性结合，高效抑制细菌毒力网络的运作。尤为重要的是，在抗击耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的体内感染模型中，streptoclipamide A与经典药物万古霉素联用，展现出卓越的协同治疗效果，显著降低了组织内的细菌数量并有效缓解了病灶损伤。

此项突破性工作，其价值超越了发现单个先导化合物本身。它成功地为抗击“超级细菌”MRSA提供了充满希望的候选药物，更重要的是，它创建并验证了一套从庞大微生物资源中定向挖掘特定活性天然产物的通用“路线图”。这套高效的研究范式，有望从根本上改变传统天然产物药物发现中“盲目筛选”的困境，为未来开发新型抗菌药物，乃至其他类型的天然药物，开辟了全新的、极具潜力的路径。

图1 自抗性基因引导与双重筛选策略发现新型ClpP抑制剂

图2 Streptoclipamides生物合成途径的推测

图3 Streptoclipamide A减轻MRSA对大蜡螟幼虫和小鼠的致病作用

原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/ange.202514683

DOI: 10.1002/anie.202514683